2019年6月21日，山东农业大学郝玉金教授课题组分别在plant Biotechnology Journal和New phytologist发表了苹果花青素合成调控方面的研究论文。
Title:MdWRKY40 promotes wounding‐inducedanthocyanin biosynthesis in association with MdMYB1 and undergoesMdBT2‐mediated degradation┃MdWRKY40促进与MdMYB1相关的伤口诱导花青素生物合成，并经历MdBT2介导的降解
Journal:New phytologist
IF:7.299
published:21 June 2019
DOI:10.1111\/nph.16008
Affiliations:Shandong Agricultural University
机械损伤会促进花青苷的合成。然而，其潜在的分子机制尚不清楚。该研究发现MdWRKY40与花青素生物合成的正调节因子MdMYB1相互作用，响应机械损伤而增强MdMYB1与其靶基因的结合，并通过MdBT2介导降解。进一步发现MdBT2与MdWRKY40相互作用并通过26S蛋白酶体途径参与其降解。该研究表明，MdWRKY40是机械损伤诱导的花青素生物合成的关键调节因子，为苹果中转录和翻译后水平的机械损伤诱导花青素生物合成的调控提供了新的见解。
Summary
Wounding stress leads to anthocyaninaccumulation. However, the underlying molecular mechanism remains elusive. Inthis study, MdWRKY40 was found to promote wounding‐induced anthocyaninbiosynthesis in association with MdMYB1 and undergo MdBT2‐mediated degradationin apple.
We found that MdMYB1, a positive regulator ofanthocyanin biosynthesis, was essential for the wounding‐induced anthocyaninbiosynthesis in apple. MdWRKY40 was identified as an MdMYB1‐interactingprotein, and enhanced the binding of MdMYB1 to its target genes in response towounding.
We found that MdBT2 physically interacted withMdWRKY40 and was involved in its degradation through the 26S proteasomepathway.
Our results demonstrate that MdWRKY40 is a keymodulator in the wounding‐induced anthocyanin biosynthesis, which provides newinsights into the regulation of wounding‐induced anthocyanin biosynthesis atboth transcriptional and post‐translational levels in apple.
损伤以MdMYB1依赖性方式促进苹果花青素生物合成
花青素参与保护植物免受外部胁迫（Winkel-Shirley，2002；Akula等，2011）。MBW蛋白复合物在调节花青素生物合成中发挥关键作用(Ramsay and Glover,2005；Allanet al.,2008)。环境因子对花青素积累的调节依赖于WBM复合体。例如，一种硝酸盐响应蛋白BT2通过降解苹果中的MYB1抑制花青素生物合成(Wang et al.,2018b)。MYB75\/pAp1对蔗糖诱导的花青素生物合成至关重要(Teng et al.,2005)。在苹果中，bHLH3有助于低温诱导的花青素积累(Xie et al.,2012)，葡萄糖传感器HXK1通过稳定苹果中的bHLH3促进葡萄糖诱导的花青素生物合成(Huet al.,2016)。然而，关于损伤诱导花青素生物合成的研究报道较少。在此，我们发现花青素生物合成相关基因可以响应伤害处理而上调（图4B），伤害以MdMYB1依赖的方式促进苹果果实花青素生物合成（图1）。
损伤响应蛋白MdWRKY40通过与MdMYB1相互作用促进损伤诱导的花青素生物合成
WRKY转录因子在植物生物和非生物胁迫响应中发挥关键作用(Rushton et al.,2010;Chen et al.,2012;phukan et al.,2016)，包括植物防御(Eulgem et al.,2007;pandey et al.,2009)、冷胁迫(Wang et al.,2014;Kim et al.,2016)、盐胁迫(Jiang and Deyholos,2009;Niu et al.,2012)、干旱胁迫(Wu et al.,2009;Ren et al.,2010;Tripathi et al.,2014)和损伤胁迫(Hara et al.,2000;Skibbe et al.,2008)。在各种胁迫反应中，WRKY转录因子在损伤响应中的作用在很大程度上是未知的。以前的研究报告烟草中的三个WRKY转录因子WIZZ、WRKY3和WRKY6响应损伤胁迫（Hara等人，2000年；Skibbe等人，2008年）。我们鉴定了苹果WRKY蛋白，MdWRKY40，它可以在转录和翻译后水平响应机械损伤（图4A和4C）。
研究表明，WRKY蛋白参与调控黄酮类化合物生物合成。在矮牵牛中，WRKY转录因子pH3作为关键的MBW靶基因，可以仅与MBW复合体的WDR成员形成复合体，控制液泡酸化和花色(Verweij et al.,2016)。与之相似，在拟南芥中，TTG2编码的同源WRKY蛋白与TTG1 WDR蛋白发生物理相互作用，控制两个黄酮类通路基因（TT12和TT13\/AHA10），参与将色素前体转运至内种皮细胞的液泡中(Gonzalez et al.,2016)。新型WRKY-MBW模块可能在调控类黄酮生物合成中发挥重要作用。在这项研究中，MdWRKY40被定性为苹果中伤口介导花青素生物合成的正调控因子（图3-5）。MdWRKY40与MBW复合体的关键组件MdMYB1相互作用（图2），并增强其靶基因的转录激活（图6）。这些结果进一步验证了WRKY-MBW调控模块在苹果中的基本作用，MdWRKY40的分子调控机制与pH3和TTG2的不同(pesch et al.,2014;Gonzalez etal.,2016;Verweij et al.,2016;Lloyd et al.,2017)。
MdBT2通过降解MdWRKY40负调控损伤诱导的花青素生物合成
越来越多的证据表明，WRKY蛋白的相互作用伴侣，包括WRKY蛋白本身、MAp激酶、CaM、VQ蛋白、组蛋白去乙酰化酶和小RNA，可能影响WRKY的活性或功能(Rushton et al.,2010；Chi et al.,2013)。损伤触发了MdWRKY40的积累（图4C），这刺激我们研究MdWRKY40响应损伤响应的翻译后调控机制。并且确认MdBT2是MdWRKY40的一个相互作用伴侣（图7）。MdBT2是花青素生物合成的抑制因子，它通过降解MdMYB1和MdMYB9抑制花青素生物合成(An et al.,2018a；Wang et al.,2018b)。此外，MdBT2通过降解MdbZIp44（一种MdMYB1相互作用蛋白）负调控ABA诱导的花青素生物合成(an et al.,2018)。研究表明，MdBT2也抑制损伤诱导的苹果果实花青素生物合成（图8）。此外，我们发现损伤促进了MdBT2的蛋白降解（图9B），尽管MdBT2在转录水平上对机械损伤没有反应（图9A，Kranthi等，2009）。作为下游基质(Zhao et al.,2016;An et al.,2018a,2018b;Wang et al.,2018b) , MdWRKY40通过26S蛋白酶体系统经MdBT2介导的降解（图12）。结果表明，MdBT2可通过干扰MdWRKY40蛋白的稳定性，抑制伤口诱导的花青素生物合成（图10-11）。
先前的报告表明MdBT2与MdMYB1相互作用(Wang et al.,2018b)。实验证明，MdMYB1与MdWRKY40直接相互作用（图2），MdWRKY40与MdBT2直接相互作用（图7）。因此，这三种蛋白似乎通过成对相互作用或通过形成多蛋白复合物在伤口诱导的花青素生物合成中执行其调控功能。
总之，我们的结果为损伤诱导花青素生物合成的潜在分子机制提供了新的线索（图13）。MdWRKY40是创伤性花青素生物合成的正调控因子，它与MdMYB1直接相互作用，增强与花青素生物合成基因MdMYB1启动子的结合。在没有受伤的情况下，MdBT2通过26S蛋白酶体途径降解MdWRKY40，并进一步负调控MdWRKY40促进的花青素生物合成。在受伤的情况下，MdWRKY40的转录升高，促进花青素生物合成。同时，受伤加速了MdBT2的降解，并从MdBT2介导的降解中释放MdWRKY40，这也促进了受伤诱导的花青素生物合成。
WRKY40蛋白已被证明参与ABA信号响应(Chen et al.,2010;Liu et al.,2012)、抵御病原体(Xu et al.,2006;pandey et al.,2010;Abeysinghe et al.,2018;Chakraborty etal.,2018;Wang et al.,2018a)和耐盐性(Dai et al.,2018)。WRKY40在响应受伤和调节花青素生物合成中的作用可能丰富WRKY40蛋白的功能研究。考虑到花青素在保护植物免受外部胁迫方面发挥的重要作用(Winkel-Shirley,2002;Akula et al.,2011)以及WRKY40对各种胁迫表现出的广泛胁迫响应，我们提出BT2-WRKY40-MYB1可能是一个普遍的调节模块，涉及苹果甚至其他植物的不同胁迫响应。
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